原位雜交實驗要求及步驟可以歸納為以下幾點：
一、實驗要求
- 組織取材應盡可能新鮮，由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細胞最好在30分鐘內(nèi)固定。
- 為保持細胞結(jié)構(gòu)、最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA的水平以及使探針易于進入細胞或組織，需要選擇適當?shù)墓潭▌Ｗ畛Ｓ玫墓潭▌┦嵌嗑奂兹?，它不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因此不會影響探針穿透入細胞或組織。
二、實驗步驟
- 組織取材與固定：
- 取材后應盡快進行固定，以保持組織的原始狀態(tài)。
- 常用的固定劑如多聚甲醛，固定時間一般為4小時。
- 增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：
- 雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10分鐘，以降低背景。
- 探針制備與檢測：
- 制備特異性探針，可以是DNA或RNA序列，用熒光素、酶或同位素等進行標記。
- 對探針進行敏感性檢測，確保探針的有效性。
- 雜交：
- 將標記的探針與樣品中的目標序列進行雜交。
- 雜交通常在高溫下進行，以增加探針與目標序列的特異性結(jié)合。
- 洗滌與檢測：
- 洗滌以去除未結(jié)合的探針和非特異結(jié)合物。
- 使用熒光顯微鏡觀察、酶反應染色或同位素探測等方法顯示雜交信號。
- 結(jié)果分析：
- 通過顯微鏡觀察或其他圖像分析方法解讀和分析雜交結(jié)果。
評估信號的位置、強度和特異性。
請注意，具體的實驗條件和步驟可能會根據(jù)研究目的和樣本類型的不同而有所調(diào)整。同時，實驗過程中應嚴格遵守安全規(guī)范，特別是當使用熒光素或輻射性同位素等標記物質(zhì)時。
