核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)中的八大重要因素

（1）探針選擇：
根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。
1、檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針；
2、在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針（通過(guò)克隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可；
3、檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體應(yīng)選用特異性較強(qiáng)的長(zhǎng)的雙鏈DNA探針；
4、組織原位雜交應(yīng)選用寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80～150bp），因?yàn)樗淄高^(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。
（2）探針標(biāo)記方法：
在選擇探針類型的同時(shí)，還需要選擇標(biāo)記方法。探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時(shí)，還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。
放射性探針的實(shí)際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機(jī)引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測(cè)單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的探針標(biāo)記方法。在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。
（3）探針濃度：
隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。
（4）雜交率：
傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNA復(fù)性研究，在這種情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同。現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無(wú)論在液相雜交還是固相雜交均在探針過(guò)剩的條件下進(jìn)行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計(jì)算。
（5）雜交溫度：
雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm的 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。
（6）雜交的嚴(yán)格性：
影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體Tm值25℃時(shí)雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式計(jì)算雜交體Tm 值。通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性。
（7）雜交反應(yīng)時(shí)間：
在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。
（8）雜交促進(jìn)劑：
體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高。